VII. SPEKTROFOTOKOPI UNTUK PENENTUAN KADAR PROTEIN
A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Protein adalah bagian terbesar tubuh sesudah air, seperlima bagian tubuh adalah protein. Semua enzim berbagai hormone pengangkut zat-zat gizi dan darah, matrik intraseluler dan sebagainya adalah protein. Protein yang berfungsi membangun, serta memelihara sel-sel dan jaringan tubuh adalah fungsi khas yang tidak dapat digantikan oleh zat gizi lain. Molekul pada protein lebih kompleks daripada kerbohidrat dan lemak, hal ini kerena molekul dan keanekaragaman unit-unit asam amino yang membentuknya.
Mutu protein ditentukan oleh jenis dan proporsi asam amino yang dikandungnya. Semua protein hewani kecuali gelatin merupakan protein tidak komplit atau protei bermutu rendah atau juga protei yang tidak mengandung kurang dari 1 atau lebih asam amino essensial. Campuran 2 jenis protein nabati atauu penambahan sedikit protein hewani ke protein nabati akan menghasilkan protein bermutu tinggi dengan harga relatif murah.
Dan untuk menentukan kadar protein digunakan spektrofotokopi. Metode spektrofotokopi dengan ultraviolet, dalam spektrofotokopi ultra ungu energi cahaya yang tampak terserap digunakan untuk transfusi elektron. Karena energi cahaya ultraviolet dapat menyebabkan transfusi elektron.
Pengukuran kadar protein dengan metode Lowry adalah dasar penggunaan spektrofotokopi. Warna biru yang terjadi oleh pereaksi folin ciacalteu disebabkan reaksii antara protein dengan Cu dalam larutan alkalis dan terjadi reaksi garam fosfotungstat dan garam fosfomolibdat oleh tirosin dan triptopan.
Protein dengan garam fostotungstat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya tergantung pada konsentrasi protein yang tertera pada konsentrasi yang diukur berdasarkan ats optikal dencinty pada panjang gelombang tertentu untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan.
2. Tujuan Praktikum
Dalam praktikum acara VII ini bertujuan untuk menenttukan kadar protein pada sampel dengan metode spetrofotokopi.
3. Waktu dan Tempat
Dalam praktikum VII ini dilalaksanakan pada hari Rabu, 1 Desembar 2010, pukul 07.30-09.30 WIB. Di Laboratorium Biologi Tanah Universitas Sebelas Maret Surakarta.
B. Tinjauan Pustaka
Sebagian besar ilmu kimia organisme hidup menyangkut 5 golongan senyhawa utama yaitu: karbohidrat, lipida, mineral, asam nukleat, dan protein. Protein menentukan kebanyakan sifat-sifat yang ditemukan dalam kehidupan. Protein juga menentukan metabolism membentuk jaringan dan memberikan kemungkinan bagi kita untuk bargerak. Protein juga berfungsi mengangkut senyawa-senyawa dan melindungi kita dari penyebaran mikroorganisme yang merugikan. Bahkan sifat-sifat yang diturunkan oleh suatu organism untuk membentuk bermacam-macam jenis protein dengan kecepatan yang berbeda (Gilvery, 1996).
Protein memiliki molekul beser dengan berat molekul berfariasi antara 5000 hingga jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau enzim, protein akan menghasilkan asam-asam amino. Ada 20 jenis asam amino yang terdapat molekul protein. Asam-asam amino ini terikat satu dengan lain oleh ikatan peptida. Protein mudah dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH, dan pelarut organic (Riawan, 1990).
Protein pada setiap bahan kadarnya berbeda-beda. Pengukuran kadar protein suatu bahan sangat diperlukan karena erat kaitannya dengan tingkat konsumsi manusia. Pengukuran kadar protein dengan menggunakan metode Lowry adalah dasar dari penggunaan spektrofotometer (Ahmad, 1997).
Alat yang digunakan untuk mengukur panjang gelombang absorbansi suatu larutan yaitu spektrofotometer, macam-macam spektrofotometer diantaranya spektrofotometer ultra ungu (UV), sinar tampak, dan inframerah yang dibuat atas dasar yang sama. Pelarut spektrofotometri yang dapat digunakan adalah semua cairan tertentu yang dapat diproleh dalam bentuk murni. Letak maksiimum absorbansi tergantung pada pelarut yang digunakan dan akan bergeser kea rah panjang gelombang yang lebih panjang dengan bertambahnya polaritas pelarut.
Perbesaran skala yang ditemukan agar pembacaan lebih teliti, digunakan untuk membandingkan dua larutan yang barwarna pekat. Apabila untuk analisis kedua larutan tersebut, digunakan air sebagai standart, maka air akan meneruskan radiasi sinar lebih daripada larutan berwarna, sehingga hal ini menyebabkan perbedaan transmisi diantara kedua larutan berwarna pekat tersebut kecil. Dengan mengganti larutan standart air dengan larutan standart berwarna maka perbedaan transmisi diantara kedua larutan berwarna pekat akan didapat lebih teliti (Harjadi, 1976).
C. Alat, Bahan, dan Cara Kerja
1. Alat
a. Tabung reaksi
b. Rak tabungn reaksi
c. Pipet
d. Gelas ukur
e. Spektrofotometer
2. Bahan
a. Larutan BSA susu dan kedelai
b. Aquadest
c. Reagen A (Na2CO3 dalam NaOH)
d. Reagen B (CuSO4 dalam aquadest)
e. Reagen C (K-tartat dalam aquadest)
f. Reagen D (campuran A; B; C = 20: 1: 1)
g. Reagen E (Fiolin Ciocalteu dalam eter)
3. Cara Kerja
a. Memasukkan 1 ml larutan BSA susu dalam tabung reaksi, dan 1 ml larutan BSA kedelai dalam tabung reaksi yang lain.
b. Menambahkan 1 ml reagen D dalam masing-masing tabung reaksi, kemudian menggojoknya dan mendiamkannya selama 15 menit.
c. Setelah 15 menit lalu menambahkan 3 ml reagen E,menambahkan 5 ml aquadest. Menggojok dan mendiamkannya selama 45 menit.
d. Mengukur absorbansinya dengan spektrofotometer.
D. Hasil dan Analisis Hasil Pengamatan
1. Hasil Pengamatan
Tabel 7.1 Pengukuran Absorbansi Larutan BSA
| X | Y |
| 0 | 0,00 |
| 0,2 | 0,105 |
| 0,4 | 0,199 |
| 0,6 | 0,204 |
| 0,8 | 0,288 |
| 1 | 0,365 |
Sumber: Laporan Sementara
Tabel 7.2 Pengukuran Absorbansi Sampel
| Sampel | Y ( Absorbansi ) | Volum (ml) |
| Susu | 0,235 | 10 ml |
| Kedelai | 0,125 | 10 ml |
Sumber: Laporan Sementara
2. Analisis Hasil Pengamatan
a. Menentukan garis regresi dengan persamaan , nilai dan dapat dicari dengan menggunakan perhitungan pada kalkulator, yang kemudian didapatkan:
Sehingga garis regresinya diperoleh:
( 0; 0,023 )
( -0,068; 0 )
b. Menentukan kadar protein susu dan kadar protein kedelai. Dengan menentukan nilai X pada susu dan kedelai terlebih dahulu.
X susu:
Dan garis sampelnya ( 0,625;0,235 )
Kadar protein susu:
X kedelai:
Dan garis sampelnya ( 0,3;0,125 )
Kadar protein kedelai:
E. Pembahasan dan Kesimpulan
1. Pembahasan
Pada praktikum kali ini, dilakukan percobaan penentuan kadar protein dengan menggunakan spektrofotokopi. Spektrofotokopi adalah alat atau cara analisis kimia yang populer. Yaitu spektrofotometer UV-VIS yang berprinsip kerja reaksi antara radiasi elektromagnetik dengan partikel bahan.
Pada praktikum ini menggunakan standard protein yang merupakan penentu keberhasilan analisis kualitatif. Larutan bovine serum albumin (BSA) susu dan kedelai. Dalam praktikum kali ini larutan standar dan reagen D serta reagen E telah disediakan. Kami selaku praktikan hanya melakukan percobaan pengukuran absorbansi pada sampel susu dan sampel kedelai, dimana pada percobaan diambil 1 ml larutan sampel BSA susu, yang kemudian dimasukkan dalam tabung reaksi. Lalu ditambah 1 ml reagen D dan digojog, kemudian didiamkan selama 15 menit. Setelah 15 menit ditambahkan 3 ml reagen E, digojog, taklupa ditambah 5 ml aquades dan didiamkan selama 45 menit. Begitupula perlakuan pada larutan sampel BSA kedelai, juga diambil 1 ml ditambah 1 ml reagen D, digojog, didiamkan 15 menit, kemudian ditambah reagen E dan 5 ml aquades. Setelah 45 menit larutan ini ditentukan konsentrasinya dengan spektrofotometer.
Yang kemudian dapat digunakan untuk menghitung persamaan garis regresi dan kadar protein. Untuk membuat kurva (grafik) larutan standard dan absorbansi sampel. Dimana dalam perhitungan kadar protein harus dicari nilai x dari susu dan kedelai. Nilai X susu dan nilai X kedelai berturut-turut: 0,625 dan 0,3. Nilai X ini kemudian digunakan dalam perhitungan kadar protein susu dan kedelai, diproleh kadar protein susu 12,5% dan kadar protein kedelai 6%. Dan di peroleh persamaan garis regresi Y= 0,023 + 0,339X Disini di peroleh kadar protein susu 12,5% yang lebih besar dari kadar protein kedelai yaitu sebesar 6%. Menurut teori kadar protein dalam protein hewani lebih besar dari protein nabati. Selain itu juga nilai absorbansi pada larutan sampel susu lebih tinggi daripada larutan sampel kedelai.
2. Kesimpulan
Dari percoban dan uraian diatas maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut:
a. Pada larutan BSA didapatkan persamaan garis regresi Y = 0,023 + 0,339X.
b. Garis absorbansi larutan BSA dengan garis absorbansi sampel berbanding lurus.
c. Garis absorbansi larutan BSA dengan garis regresi juga berbanding lurus.
d. Garis absorbansi sampel dengan garis regresi juga berbanding lurus.
e. Kadar protein tertinggi dari percobaan adalah kadar protein dari susu yaitu: 12,5%.
